WRN helikaz aktivitesinin tespiti ve WRN proteininin hedefli yıkımı ile potansiyel anti-kanser etkisinin araştırılması

WRN proteini DNA’nın çift zincirinin 3’-5’ yönünde ATP bağımlı olarak çözülmesini sağlayan bir helikaz enzimidir (Shen, 2000). DNA’nın alternatif yapıları olan DNA-RNA hibritlerini, çatallanmış DNA’yı, D-looplarını, baloncuk ve parçalı dubleks DNA’ları, tripleks DNA oluşumlarını ve DNA G4 kuadrupleks (G dörtlüsü) adı verilen DNA’nın oluşturduğu kompleks yapıların da açılımını sağlayabilen bir helikazdır (Ozgenc & Loeb, 2006). Bu özelliklere sahip olmaları nedeniyle rekombinasyon ile bağlantılı olan DNA tamir mekanizmalarında, replikasyon ve transkripsiyon proseslerinde aktif rol almaktadır (Luo, 2010; Bohr, 2008). Bunun yanında iki veya daha fazla gendeki değişikliklerin hücreyi ölüme götürmesi anlamına gelen sentetik letalite kavramı WRN mutasyonları ile de ilişkilendirilmektedir. Hem DNA tamir mekanizmalarında aktif rol alıyor olması hem de sentetik letalite için bir hedef olması WRN’yi kanser çalışmalarında ön plana çıkarmaktadır. Bu çalışmada, proteozomal yolak aracılığıyla hedefli WRN proteini yıkımının, tasarlanan PROTAC molekülü ile gerçekleştirilmesi ve mikrosatellit instabilitesine sahip kolon kanseri hücrelerinde degradasyona bağlı sentetik letal etki elde edilmesi hedeflenmiştir. İnhibitörlerin ve kemoterapi ilaçlarının birçok yan etkiye sahip olması ve ilaç dirençliliğine neden olması, bilim insanlarını kanser için alternatif tedavi yöntemlerinin arayışına itmiştir. PROTAC’lar, inhibitörlere ve diğer gen susturma yöntemlerine alternatif olarak değerlendirilmektedir. Hücrede tekrar kullanılabiliyor olması, düşük dozlarda etki etmesi toksisitenin önüne geçilmesini sağlamaktadır. Bunlara bağlı olarak bu çalışmada, bir ucu WRN proteinine bağlanan ve diğer ucu E3 ligaz enzimine tutunan ve WRN proteininin degradasyonunu sağlayacak olan bir molekül tasarlanmış olup, mikrosatellit instabilitesine sahip HCT-116 ve mikrosatellit stabilitesine sahip SW480 kolon kanseri hücre hatlarıyla çalışılmıştır. Üretilen WRNPROTAC molekülünün WRN degradasyonuna bağlı olarak mikrosatellit instabilitesine sahip hücrelerde sentetik letalite gösterdiği kanıtlanmıştır. Tez kapsamında ayrıca, G-kuadrupleks yapısına sahip ve WRN substratı olarak bilinen SHOX geninin bir bölgesinin sentetik oligomerinin Förster Tipi Enerji Transferi (FRET) yöntemi ile WRN aktivitesinin tespiti için kullanım potansiyeli incelenmiştir.

WRN Protein is an helicase enzyme responsible for ATP-dependent unwinding of double stranded DNA in the direction of 3’-5’ (Shen, 2000) Alternative DNA structures such as DNA-RNA hybrids, DNA forks, D-loops, bubbles, partial duplex DNA, triplex DNA, G- quadruplexes (G-quartets) are substrates of this helicase (Ozgenc & Loeb, 2006) Because of these properties, enzyme is involved in various processes including DNA damage repair associated with recombination, replication and transcription ((Luo, 2010); (Bohr, 2008)). In addition, the concept of synthetic lethality, which means that changes in two or more genes leading to cell death, is associated with the WRN mutations. Both its active role in DNA repair mechanisms and being a target for synthetic lethality bring WRN to the forefront in cancer studies. In this study, it was aimed to perform targeted WRN protein degradation via proteasomal pathway with the designed PROTAC molecule and to obtain synthetic lethal effect due to degradation in colon cancer cells with microsatellite instability. The fact that inhibitors and chemotherapy drugs have many side effects and cause drug resistance has led scientists to search for alternative treatment methods for cancer. PROTACs are evaluated as alternatives to inhibitors and other gene silencing methods. PROTACs can be reused in the cell, they can be effective at low doses with minimal toxicity. Accordingly, in this study, a molecule that binds to WRN protein at one end and E3 ligase enzyme at the other end and provides degradation of WRN protein was designed and studied with HCT-116 colon cancer cell line with microsatellite instability and SW480 colon cancer cell line with microsatellite stability. It has been proven that the produced WRNPROTAC molecule shows synthetic lethality in cells with microsatellite instability due to WRN degradation. In addition, using the Förster Energy Transfer (FRET) method, potential use of synthetic SHOX oligomer, a G-quadruplex bearing WRN substrate, for the detection of WRN enzyme activity was investigated in the thesis.