Staphylococcus aureus klinik suşlarında virülans faktörleri ve quorum sensing genlerinin araştırılması

Son yıllarda dünya çapında giderek artan sıklıkta hastane ve toplum kaynaklı salgınlarla gündeme gelen Staphylococcus aureus ilişkili enfeksiyonların önemli bir nedenidir. Özellikle çoklu ilaca dirençli (MDR) S. aureus 'un artık büyük klinik öneme sahip olduğu kabul edilmektedir. Metisiline dirençli S.aureus (MRSA), birçok antibiyotiğe karşı dirençli olup, tedavi süreçlerinde kullanılan modern antibiyotiklere hızla direnç geliştirme yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, MRSA enfeksiyonları, normal S. aureus enfeksiyonlarına kıyasla daha güçlü ve inatçı enfeksiyonlara yol açmaktadır. S. aureus suşları tarafından salgılanan Panton-Valentine lökosidin (PVL) toksini, toplum kaynaklı deri ve yumuşak doku enfeksiyonları ile ölümcül nekrotizan pnömonilerden sorumlu tutulan önemli bir toksindir. Bunun yanında S. aureus quorum sensing (QS) sistemlerinin biyofilm üretimi gibi çeşitli hücresel mekanizmalarda kilit rol oynadığı ve varolan antibiyotik direncinin güçlenmesine sebep olduğu gösterilmiştir. S. aureus metisilin direncinde mecA ve mecC genleri sorumludur. Bakterilerdeki QS mekanizması, biyofilm üretimi vb. dirence katkı sağlayan ve virülansı arttıran bazı yetenekleri organize etmektedir ve bu mekanizmayı inhibe edebilecek “Quorum Quencher” arayışı son zamanlarda artmıştır. Bu tür bileşiklerin QS mekanizmasını inhibe etmesi ve dolayısıyla bakterilerde ilaç direnci gelişimini azaltması/engellemesi beklenmektedir. QS sistemlerine sahip S. aureus suşlarının, bu mekanizmayı regüle eden genlerden bazıları AgrA ve AgrC genleridir. Kongo kırmızı biyofilm olulumunda fenotipik değerlendirmede kullanılan bir yöntemdir. Günümüzde bakteriler tüm antibiyotiklere karşı hayatta kalmak için farklı yollarla direnç geliştirme yeteneğine sahiptirler. Bakteriler arasındaki QS mekanizmasının inhibe edilerek; bu sistemle regüle edilen virülans faktörleri, biyofilm oluşumu ve bakteriyel direnç mekanizmalarının zayıflatılma stratejisi dirençli bakteriyel enfeksiyonların önlenmesinde umut vadetmektedir. Bu nedenle bakterilerin QS ve antibiyotik direnç mekanizmaları arasındaki ilişkinin daha da aydınlatılması gerekmektedir. Çalışmamızda çeşitli klinik örneklerden izole edilen, identifikasyonu MALDI-TOF MS (bioMerieux, Marcy l'Etoile, France) yapılmış, antibiyotik duyarlılıkları BD Phoenix otomatize sistemi (Becton-Dickinson, ABD) ile tespit edilmiş 100 adet S. aureus suşu kullanılmıştır. Mec A, mec C, Luks PVL1-2 ve QS genleri olan agrA, agrC RT-PCR ile tespit edilmiştir. Çalışmamızda housekeeping gen olarak 16s rRNA kullanılmıştır. Suşlardan izole edilen DNA Titertek Berthold Colibri Microvolume Spectro Nanodrop ölçümü ve jel elektroforezi ile doğrulanmıştır. RT-PCR bulgularımıza göre, QS genleri AgrA ve AgrC'yi birlikte taşıyan izolatlar QS (+) olarak, geri kalan izolatlar ise QS (-) olarak iki gruba ayrılmıştır. Bu gruplar arasında çeşitli antibiyotiklere karşı direnç düzeyleri ve ilgili antibiyotik direnç genlerinin varlığı karşılaştırılmıştır. Aynı zamanda kongo kırmızı ile fenotipik değerlendirme neticesinde moleküler yöntemlere ihtiyaç duymadan da biyofilm varlığının anlaşılabilirliğinin tespiti yapılmıştır. Elde ettiğimiz bulgular, QS genleri ile sefoksitin, oksasilin, klindamisin ve tetrasiklin direnç düzeyleri ve mecA geninin varlığı arasında ilişki olabileceğini destekler nitelikte literatüre katkı sunmaktadır. Bir direnç geni olan mecC geni hiçbir izolatta tespit edilememiştir. S. aureus MDR bakterilerin tür içi seçiliminde QS sistemlerinin rol oynayabileceğini ve dolayısıyla MDR suşların ortaya çıkmasında etkili olabileceğini düşündürmektedir. Ancak bu alanda daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. PVL toksin geninin varlığı mecA pozitifliğinde deri ve yumuşak doku enfeksiyonlarında çok daha fazla ortay çıktığı gösterilmiştir. MecA geninin inhibe edileerek MRSA oluşumun izlenmesi, ayrıca çeşitli inhibitörlerin kullanılması gerekmektedir. S. aureus enfeksiyonlarında antibiyotik direnciyle mücadelede umut vadeden QS inhibisyonu stratejisinin ilerleme kaydetmesi, antibiyotik direnciyle mücadelede yeni bir dönemin başlangıcı olabilir. Bu çalışmamızda S. aureus suşlarının virülans faktörlerini, quorum sensing özelliklerini gen düzeyinde araştırmak ve beta-laktam antibiyotikleri üzerindeki olumlu ya da olumsuz etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.

In recent years, Staphylococcus aureus has emerged as a significant cause of hospital and communityassociated outbreaks worldwide. Particularly, multidrug-resistant (MDR) S.aureus is now recognized as having major clinical importance. Methicillin-resistant S.aureus (MRSA) is resistant to many antibiotics and has the ability to rapidly develop resistance to modern antibiotics used in treatment processes. Therefore, MRSA infections lead to stronger and more persistent infections compared to normal S.aureus infections. The PantonValentine leukocidin (PVL) toxin secreted by S.aureus strains is an important toxin held responsible for community-associated skin and soft tissue infections, as well as fatal necrotizing pneumonia. Additionally, it has been shown that S.aureus quorum sensing (QS) systems play a key role in various cellular mechanisms such as biofilm production and contribute to the enhancement of existing antibiotic resistance. Methicillin resistance in S.aureus is attributed to the mecA and mecC genes. The QS mechanism in bacteria organizes some abilities that contribute to resistance, such as biofilm production, and increase virulence. The search for “Quorum Quenchers” that can inhibit this mechanism has recently increased. It is expected that such compounds will inhibit the QS mechanism and consequently reduce/prevent the development of drug resistance in bacteria. Some of the genes regulating the QS mechanisms in S.aureus strains are AgrA and AgrC genes. Congo red is a method used for phenotypic evaluation in biofilm formation. Today, bacteria have the ability to develop resistance to all antibiotics through different mechanisms. Inhibiting the QS mechanism among bacteria and thereby weakening the virulence factors, biofilm formation, and bacterial resistance mechanisms regulated by this system is a promising strategy for preventing resistant bacterial infections. Therefore, it is necessary to further elucidate the relationship between bacterial QS and antibiotic resistance mechanisms. In our study, 100 S. aureus strains isolated from various clinical samples were used. These strains were identified using MALDI-TOF MS (bioMerieux, Marcy l'Etoile, France), and their antibiotic susceptibilities were determined using the BD Phoenix automated system (Becton-Dickinson, USA). Mec A, mec C, Luks PVL1-2, and the QS genes agrA and agrC were detected by RT-PCR. In our study, 16s rRNA was used as the housekeeping gene. The DNA isolated from the strains was verified by Titertek Berthold Colibri Microvolume Spectro Nanodrop measurement and gel electrophoresis. According to our RT-PCR findings, isolates carrying both QS genes AgrA and AgrC were classified as QS (+), while the remaining isolates were classified as QS (-). Resistance levels to various antibiotics and the presence of related antibiotic resistance genes were compared between these groups. Additionally, the ability to detect biofilm presence without molecular methods was assessed through phenotypic evaluation with congo red. Our findings contribute to the literature by supporting a potential relationship between QS genes and resistance levels to cefoxitin, oxacillin, clindamycin, and tetracycline, as well as the presence of the mecA gene. The mecC gene, another resistance gene, was not detected in any isolate. This finding suggests that QS systems may play a role in the intra-species selection of S.aureus MDR bacteria and, consequently, in the emergence of MDR strains. However, further studies are needed in this area. The presence of the PVL toxin gene has been shown to be more prevalent in skin and soft tissue infections with mecA positivity. Inhibiting the mecA gene and monitoring the formation of MRSA, as well as using various inhibitors, is necessary. Advancing the promising QS inhibition strategy in combating antibiotic resistance in S.aureus infections could mark the beginning of a new era in fighting antibiotic resistance. This study aims to investigate the virulence factors and quorum sensing characteristics of S.aureus strains at the gene level and to determine their positive or negative effects on beta-lactam antibiotics.