Pankreas kanseri hücre hattında otofaji ilişkili VPS34 inhibitörünün Wnt/β-katenin sinyal yolağı üzerinden incelenmesi

Pankreas kanseri (PK) insidansı dünya çapında her yıl artmaktadır ve erken teşhisi oldukça zordur. Hastalığın gizli prognoz göstermesi, geç tanı konması ve kemoterapi/radyoterapi gibi tedavilere direnç oluşturması, pankreas kanserinin daha başarılı bir şekilde tedavisi ve erken teşhisi için yeni stratejilere acilen ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir. Kanserli hücrelerin tedavilere direnç geliştirmesinde, agresif form oluşturmasında ve yayılmasında etkili olduğu bilinen birçok moleküler mekanizma vardır ve bunlardan biri de otofajidir. Otofajinin kanserdeki rolü karmaşıktır ve tümör tipine veya içeriğine bağlı olarak değişebilir. Bunun yanında, pankreas kanseri de dahil olmak üzere birçok kanser türünde düzensizlik gösteren Wnt/β-katenin sinyal yolu ile otofaji arasındaki etkileşim farklı kanser türlerinde çalışılmıştır fakat moleküler mekanizmaları belirsizliğini korumaktadır. Bu çalışmada, insan pankreatik duktal adenokarsinom (PDAK) hücre hatları olarak PANC-1 ve MIA PaCa-2 kullanılmıştır. Otofaji düzensizliğinin altında yatan mekanizmaları daha net anlamak amacıyla otofajinin ana düzenleyicilerinden biri olan VPS34 hedeflenerek autophinib ile inhibe edilmiş, hücre canlılığına WST-8/CCK8 testi ile bakılmıştır. Otofajik aktivite LC3-II Kantitasyon ELISA kiti ile apoptotik aktivite ise Kaspaz-3 ELISA kiti ile analiz edilmiştir. Wnt/β-katenin sinyal yolu arasındaki potansiyel etkileşimi araştırmak için qRT-PZR kullanılarak hedef genlerinin ekspresyon seviyelerine bakılmıştır. Hücre canlılığı analizi ile sonraki deneylerde kullanılacak autophinib konsantrasyonu 48 saat için 5 ve 10 µM olarak belirlenmiştir. LC3-II ELISA kiti testi sonucunda 5 ve 10 µM doz grupları kontrol grubu ile kıyaslandığında otofajik aktivitede anlamlı bir azalma gözlemlenmiştir. Kaspaz-3 ELISA testi sonuçlarında ise doz gruplarında anlamlı bir apoptotik aktivite artışı görülmektedir. qRT-PZR sonuçlarına bakıldığında otofaji ve Wnt/β-katenin ilişkili genlerde anlamlı bir azalış mevcutken apoptoz genlerinde ise anlamlı bir artış saptanmıştır. Bu sonuçlardan yola çıkarak, PDAK hücre hatlarında otofajiyi baskılamanın Wnt/β-katenin sinyal yoluyla ilişkili genlerin ekspresyon seviyesinde azalmaya neden olduğu ve apoptozu hem kaspaz-3 testi hem de gen düzeyinde analiz ile arttırdığı saptanarak antikanser aktiviteye neden olabileceği gösterilmiştir.

The incidence of pancreatic cancer (PC) is increasing annually worldwide and early detection is challenging. The disease's poor prognosis, late diagnosis and resistance to treatments such as chemotherapy/radiotherapy suggest that new strategies are urgently needed for more successful treatment and early detection of pancreatic cancer. There are many molecular mechanisms known to be involved in cancer cells developing resistance to treatments, forming aggressive forms and spreading, one of which is autophagy. The role of autophagy in cancer is complex and may vary depending on tumor type or context. In addition, the interaction between autophagy and the Wnt/β-catenin signaling pathway, which is dysregulated in many cancer types, including pancreatic cancer, has been studied in different cancer types, but the molecular mechanisms remain unclear. In this study, PANC-1 and MIA PaCa-2 were used as human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) cell lines. In order to better understand the mechanisms underlying autophagy dysregulation, VPS34, one of the main regulators of autophagy, was targeted and inhibited with autophinib, and cell viability was examined by WST-8/CCK8 assay. Autophagic activity was analyzed by LC3-II Quantitation ELISA kit and apoptotic activity by Caspase-3 ELISA kit. To investigate the potential interaction between the Wnt/β-catenin signaling pathway, the expression levels of target genes were analyzed by qRT-PCR. By cell viability analysis, the autophinib concentration to be used in subsequent experiments was determined as 5 and 10 µM for 48 hours. As a result of the LC3-II ELISA test, a significant decrease in autophagic activity was observed in the 5 and 10 µM dose groups compared to the control group. In the caspase-3 ELISA test results, a significant increase in apoptotic activity was observed in the dose groups. qRT-PCR results showed a significant decrease in autophagy and Wnt/β-catenin related genes and a significant increase in apoptosis genes. Based on these results, it has been shown that suppressing autophagy in PDAC cell lines causes a decrease in the expression level of genes associated with Wnt/β-catenin signaling pathway and increases apoptosis both by caspase-3 assay and gene level analysis, and may cause anticancer activity.