In vitro üç boyutlu deri kesik yara modeli geliştirilmesi ve kanabidiolün yara iyileştirme etkisinin model üzerinde incelenmesi

Rejeneratif tıpta estetik ve işlevsel olarak deri iyileşmesi, derinin karmaşık yapısı ve dinamik sinyal yolları nedeniyle hala önemli bir zorluk teşkil etmektedir. Bu süreçlerin moleküler seviyede anlaşılması açısından, geleneksel iki boyutlu (2B) hücre kültürleri; hücre ve matris etkileşimlerini ile fizyolojik derinliği yeterince temsil edememektedir. Ancak, doku mühendisliği ilkeleriyle tasarlanan üç boyutlu (3B) modeller; hücreler arası etkileşimler, hücre dışı matris yapısı ve hava sıvı arayüzü gibi deri ile ilgili belirli unsurları başarıyla simüle edebilmektedir. Bu çerçevede, biyofonksiyonel nitelikleriyle öne çıkan Kanabidiol gibi bileşenlerin yara yenilenmesi üzerindeki potansiyelini belirlemek; yalnızca hücresel hareketlerin izlenmesini değil, aynı zamanda bu etkilerin genetik ifade düzeyindeki yansımalarının yeniden yapılandırılmış insan epidermisi ve tam katmanlı deri gibi ileri düzey in vitro üç boyutlu modellerde doğrulanmasını gerektirmektedir. Bu gelişmiş modelleme yaklaşımları, hayvan deneylerine hem etik hem de bilimsel bir alternatif sunarak, iz bırakmayan iyileşmeyi hedefleyen yenilikçi farmasötik taşıyıcı sistemlerin geliştirilmesinde temel bir rol oynamaktadır. Tez çalışmanın başlangıç bölümünde, CBD insan dermal fibroblast (HDF) ve insan keratinosit (HS2) hücreleri üzerinde farklı konsantrasyonları WST-1 canlılık testi ile incelenmiştir. Analizlerin bulgularına göre, 12,5 μM seviyesine kadar hücrelerin canlılık oranının %90'ın üzerinde kaldığı, fakat 12,5 μM'yi aşan dozlarda hücre ölümünün başladığı gözlemlenmiştir. CBD'nin farklı doz ve süre uygulamalarının HDF ve HS2 hücrelerinin üremesine etkileri değerlendirildiğinde, hem 2B yara modeli hem de her iki hücrenin bir arada kullanılacağı 3B deri yara modeli için de uygulanabilecek olan 12,5 μM konsantrasyon toksik olmayan güvenli doz olarak belirlenmiştir. İkinci aşamada CBD'nin keratinositlerin göçü üzerindeki etkisi, HS2 hücreleri kullanılarak oluşturulan 2B çizik modelinde zamana bağlı olarak (0. , 1. , 2. ve 7. gün) hem ters mikroskop hem de konfokal mikroskop ile gözlemlenmiştir. CBD uygulaması, 2 boyutlu çizik testinde yara kapanmasını önemli ölçüde artırarak iki gün içinde %99,9 oranında kapanma sağlamıştır. CBD uygulanan hücrelerdeki yara kapanma oranı, kontrol grubuna göre 3,83 kat daha yüksek olmuştur. Bu bulgular, CBD'nin yara iyileşmesini destekleyici özelliklerini vurgulamakta ve farmakolojik ajanların değerlendirilmesinde gelişmiş in vitro modellerin faydasını ortaya koymaktadır. Bu morfolojik değişikliklerin moleküler altyapısını anlamak amacıyla yapılan RT-qPCR incelemeleri; epidermal farklılaşma ve bariyer dengesinin sağlanmasında önemli rol oynayan Keratin 10 (K10), Laminin (LAM) ve Involukrin (INV) genlerinin ifade seviyelerinin belirgin bir şekilde yükseldiğini göstermiştir. Bu bulgu, CBD'nin iyileşme sürecini yalnızca fiziksel bir yarayı kapama şeklinde değil, genetik düzeyde programlanmış matris sentezi ve hücresel uyum süreci olarak başlattığını ortaya koymaktadır. Üçüncü aşamada, insan derisi fizyolojisini en gerçekçi şekilde modelleyen in vitro 3B yeniden yapılandırılmış insan epidermisi (RHE) ve tam katmanlı deri (FTSE) modelleri yapılmıştır. RHE modelinde yara iyileşmesinin doğal fazlarını temsil eden 7, 14 ve 21. günlerde XTT canlılık testi ile analiz edilmiştir. Analizlerin bulgularına göre, metabolik aktivite ve yeniden epitelizasyonda, yaralanma sonrasında CBD uygulanan gruplardaki metabolik aktivitenin kontrol grubuna oranla daha dengeli kaldığını ortaya çıkartmıştır. Bu denge, CBD'nin yalnızca hücre hareketliliğini hızlandırmakla kalmayıp, aynı zamanda dokunun yeniden yapılanma süreçlerindeki enerji metabolizmasını da desteklediği anlamına gelmektedir. Konfokal mikroskopi analizinde ise epidermal bariyerin CBD etkisiyle yeniden oluştuğu gözlemlenmiştir. 21 günlük takip süreci, CBD'nin dermal fibroblastların matris üretimini uyumlu hale getirerek doku olgunlaşmasını geliştirdiğini ve daha dayanıklı bir deri benzeri yapı oluşturduğunu göstermiştir. Histolojik (H ve E) analizler ve taramalı elektron mikroskop (SEM) görüntüleme ile de CBD'nin modellerde açılan yaranın kapanmasına katkı sağladığı gösterilmiştir. Geliştirilen bu modelleme yaklaşımı, hayvan deneylerine etik bir alternatif sunan 3R prensibi ile uyumlu olup, kronik ve akut yaraların tedavisinde CBD temelli yeni nesil yara bakım sistemlerinin geliştirilmesi için hem moleküler hem de dokusal düzeyde güçlü bir temel sunmaktadır.

In regenerative medicine, achieving aesthetically and functionally effective skin healing remains a significant challenge due to the complex structure of the skin and its dynamic signaling pathways. In terms of understanding these processes at the molecular level, traditional two-dimensional (2D) cell cultures fail to adequately represent cell–matrix interactions and physiological depth. However, three-dimensional (3D) models designed based on tissue engineering principles can successfully simulate specific skin-related features such as cell–cell interactions, extracellular matrix structure, and the air liquid interface. In this context, determining the potential of biofunctional components such as cannabidiol (CBD) in wound regeneration requires not only monitoring cellular behaviors but also validating the genetic expression-level effects of these interactions in advanced in vitro 3D models, such as reconstructed human epidermis and full-thickness skin. These advanced modeling approaches provide both an ethical and scientific alternative to animal experiments and play a fundamental role in the development of innovative pharmaceutical delivery systems aimed at scarless healing. In the initial phase of the thesis study, different concentrations of CBD were evaluated on human dermal fibroblast (HDF) and human keratinocyte (HS2) cells using the WST-1 viability assay. According to the findings, cell viability remained above 90% up to a concentration of 12.5 μM, whereas cell death was observed at doses exceeding 12.5 μM. When assessing the effects of different doses and exposure durations of CBD on the proliferation of HDF and HS2 cells, 12.5 μM was determined as a non-toxic and safe concentration applicable to both the 2D wound model and the 3D skin wound model involving co-culture of both cell types. In the second phase, the effect of CBD on keratinocyte migration was evaluated using a 2D scratch assay model created with the HS2 cell line. Observations were conducted over time (day 0, 1, 2, and 7) using both inverted and confocal microscopy. CBD treatment significantly enhanced wound closure in the 2D scratch assay, achieving 99.9% closure within two days. The wound closure rate in CBD-treated cells was 3.83 times higher than in the control group. These findings highlight the wound-healing potential of CBD and demonstrate the utility of advanced in vitro models in evaluating pharmacological agents. To understand the molecular basis of these morphological changes, RT-qPCR analyses revealed a significant upregulation in the expression levels of Keratin 10 (K10), Laminin (LAM), and Involucrin (INV), which play crucial roles in epidermal differentiation and barrier homeostasis. These results indicate that CBD initiates the healing process not merely as physical wound closure but as a genetically programmed process involving matrix synthesis and cellular coordination. In the third phase, advanced in vitro 3D models that most closely mimic human skin physiology, reconstructed human epidermis (RHE) and full-thickness skin equivalents (FTSE) were developed. In the RHE model, wound healing was analyzed using the XTT viability assay on days 7, 14, and 21, representing the natural phases of healing. The results demonstrated that metabolic activity and re-epithelialization remained more balanced in CBD-treated groups compared to controls following injury. This balance suggests that CBD not only accelerates cell migration but also supports energy metabolism during tissue remodeling. Confocal microscopy analysis further showed that the epidermal barrier was re-established under the influence of CBD. The 21-day observation period indicated that CBD enhances tissue maturation by harmonizing matrix production of dermal fibroblasts, resulting in a more robust skin-like structure. Histological (H and E) analyses and scanning electron microscopy (SEM) imaging also confirmed that CBD contributes to wound closure in the developed models. This modeling approach is aligned with the 3R principles, offering an ethical alternative to animal experimentation, and provides a strong molecular and tissue-level foundation for the development of next-generation CBD-based wound care systems for both chronic and acute wound treatment.