İshalli hastalarda entamoeba hıstolytıca sıklığının mikroskobik bakı, elısa ve pcr yöntemleri ile araştırılması

Amaç: Entamoeba histolytica derin konak doku hasarı yapma yeteneğine sahip bir ishal patojenidir. Benzer ancak patojen olmayan türlerin varlığından dolayı rutin tanıda önemli zorluklar bulunmaktadır. Çalışmamızda, ishalli hastalardan seçilen dışkı örnekleri E. histolytica varlığı açısından direkt mikroskobi, trikrom boyama, ELISA ve multipleks real-time PCR ile analiz edilmiştir. Araştırma ile E. histolytica sıklığının tespit edilmesi ve kullanılan yöntemleri karşılaştırarak tanısal değerlerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Yöntem: Çalışmamıza Necmettin Erbakan Üniversitesi Tıp Fakültesi Hastanesi’ne ishal şikayetiyle başvuran hastalardan seçilen 96 dışkı örneği dahil edilmiştir. Çeşitli servis ve polikliniklerden laboratuvarımıza gelen bu örneklerden intestinal amebiyazis şüphesiyle gönderilen, şekilsiz, sulu, kanlı ve/veya mukuslu olanlar dahil edilirken, sert ve şekilli olanlar çalışmaya alınmamıştır. Tüm örneklere; doymuş NaCl çözeltisiyle yoğunlaştırma sonrası direkt mikroskobi, Wheatley trikrom boyama, dışkıda E. histolytica’ya özgü adezin antijeni tespit eden ELISA ve multipleks real-time PCR yöntemleri uygulanmıştır. Bulgular: Çalışmada araştırılan 96 örnekten 48’i erkek, 48’i kadın hastalara aittir. Yaş aralığı 0-86 olan hastaların yaş ortalaması 37,32 (standart sapma: ±24,10) olarak hesaplanmıştır. Çocuk yaş grubunda bulunan toplam 25 hastanın yaş ortalaması ise 6,8 (standart sapma: ±5,65) olarak bulunmuştur. E. histolytica pozitiflik oranı PCR ile %22,9 (n=22), ELISA ile %20,8 (n=20) bulunmuştur. Trikrom boyama ile örneklerin %27,1’inde (n=26) E. histolytica/dispar tespit edilmiştir. Direkt mikroskobik bakıda %35,4 (n=34)’ünde şüpheli amip kist ve/veya trofozoitleri görülmüştür. Multipleks PCR’da 6 paraziter etken araştırılmış ve en sık (%34,3) B. hominis, daha sonra sırasıyla E. histolytica (%22,9), D. fragilis (%5,2) ve Cryptosporidium spp. (%1,04) pozitifliği tespit edilmiştir. Giardia intestinalis ve Cyclospora cayetanensis ise tüm örnekler için negatif bulunmuştur. 5 örnekte (%5,2) E. histolytica ve B. hominis ve 3 örnekte (%3,1) D. fragilis ve B. hominis birlikte tespit edilmiştir. PCR yöntemi referans alınarak yapılan istatistiksel analizde, direkt mikroskobinin duyarlılığı %31,8, özgüllüğü %63,5; Wheatley trikrom boyamanın duyarlılığı %40,9, özgüllüğü %77; ELISA yönteminin duyarlılığı %72,7 ve özgüllüğü %94,5 olarak hesaplanmıştır. Sonuç: E. histolytica’nın etken olduğu amebiyazisin tanısında doğru, hızlı ve maliyet-etkin bir laboratuvar yaklaşımı kritik öneme sahiptir. Ancak patojen E. histolytica’nın, E. dispar/moshkovskii gibi apatojen türlerle morfolojik olarak identik olması gibi temel bazı sorunlarla karşılaşılmaktadır. Bu durum mikroskobinin tanısal duyarlılığını ve özgüllüğünü büyük oranda azaltmaktadır. Bu nedenle oluşturulacak tanı algoritmalarında, ELISA ve/veya PCR gibi ikinci bir yöntemin mikroskobiye eşlik etmesi, sonuçların güvenilirliğini artıracaktır.

Objective: Entamoeba histolytica is a diarrheal pathogen capable of causing deep tissue damage. The presence of morphologically similar but non-pathogenic species poses significant challenges in routine diagnosis. In our study, stool samples selected from patients with diarrhea were analyzed for E. histolytica using direct microscopy, trichrome staining, ELISA and multiplex real-time PCR. The aim of this study was to determine the prevalence of E. histolytica and to assess the diagnostic value of the methods used by comparing them. Materials and Methods: Our study included 96 stool samples selected from patients who presented to Necmettin Erbakan University Faculty of Medicine Hospital with complaints of diarrhea. Among these samples, those that were formless, watery, bloody and/or mucous were included in the study. Wheatley trichrome staining, direct microscopy after concentration with saturated NaCl solution, ELISA method to detect E. histolytica-specific adhesin antigen and multiplex real-time PCR were applied to all selected samples. Results: Of the 96 samples analyzed in the study, 48 belonged to male and 48 to female patients. The ages of the patients ranged from 0 to 86 years, with a mean age of 37,32 (SD: ±24,10). The mean age of the 25 patients in the pediatric age group was found to be 6,8 (SD: ±5,65). The positivity rate of E. histolytica was found to be 22,9% (n=22) by PCR and 20,8% (n=20) by ELISA. Using trichrome staining, E. histolytica/dispar was detected in 27,1% (n=26) of the samples. Amoebic cysts and/or trophozoites were observed in 35,4% (n=34) of the samples by direct microscopic examination. In the multiplex real-time PCR, six parasitic agents were investigated, and the most common was B. hominis (34,3%), followed by E. histolytica (22,9%), D. fragilis (5,2%), and Cryptosporidium spp. (1,04%). G. intestinalis and C. cayetanensis were found to be negative in all samples. E. histolytica and B. hominis were detected together in 5 samples (5,2%), D. fragilis and B. hominis were detected together in 3 samples (3,1%). Based on statistical analysis using the PCR method as the reference standard, the sensitivity and specificity of direct microscopy were calculated as 31.8% and 63.5%, respectively; for Wheatley’s trichrome staining, sensitivity was 40.9% and specificity was 77%; and for the ELISA method, sensitivity was 72.7% and specificity was 94.5%. Conclusion: An accurate, fast and cost-effective laboratory approach is critical in the diagnosis of amebiasis. However, a major challenge is that the pathogenic E. histolytica is morphologically identical to non-pathogenic species such as E. dispar and E. moshkovskii. This significantly limits the diagnostic sensitivity and specificity of microscopy. Therefore, in diagnostic algorithms to be established, the use of a second method such as ELISA and/or PCR alongside microscopy will increase the reliability of the results.