Kırmızı floresan protein geninin klonlanması ve Cereibacter sphaeroides O.U.001'de ekspresyonu

Cereibacter sphaeroides, fotosentetik, fakültatif anaerob ve gram-negatif bir bakteridir. Metabolik çeşitliliği ve genetik olarak manipüle edilebilme yeteneği sayesinde biyoteknolojik uygulamalarda potansiyel bir konak hücre olarak değerlendirilmektedir. Floresan proteinler, belirli dalga boylarında ışığı emerek daha uzun dalga boylarında ışık yayabilmektedir. Bu özellikleri sayesinde biyoteknoloji ve moleküler biyoloji alanında geniş bir kullanım alanına sahiptirler. Kırmızı Floresan Protein (RFP), uzun dalga boyunda emisyon yapması nedeniyle biyomedikal görüntüleme ve hücre içi analizlerde önemli bir araç olarak kullanılmaktadır. Bu tez çalışmasında, C. sphaeroides’in rekombinant protein üretimi için bir hücre fabrikası olarak kullanılabilirliğini test etmek amacıyla fruktoz ile indüklenebilen bir ekspresyon vektörü geliştirildi. Vektörün çalışabilirliğini değerlendirmek için RFP geni kullanıldı. Bu kapsamda, rfp geni, fruktoz ile indüklenebilen pFRU2 ekspresyon vektörüne klonlandı ve klonlama işleminin doğrulanması için moleküler biyolojik yöntemler kullanıldı. Çalışma kapsamında, rfp geni uygun restriksiyon enzimleri ile kesilerek pFRU2 vektörüne entegre edilmiş ve bu işlem hem geleneksel klonlama yöntemi hem de Gibson Assembly yöntemi ile gerçekleştirildi. Rekombinant vektör, C. sphaeroides O.U.001 suşuna konjugasyon ile aktarıldı ve başarılı klonların belirlenmesi amacıyla koloni PCR, restriksiyon enzimi kesim analizi ve dizileme yöntemleri kullanıldı. Elde edilen sonuçlar, rfp’nin pFRU2 vektörüne başarıyla klonlandığını ve rekombinant suşların doğrulandığını gösterdi. RT-qPCR analizleri, hedef genin transkripsiyon seviyelerinin belirlenmesine yönelik gerçekleştirildi ve rfp transkriptlerinin varlığı tespit edildi. Ancak, protein düzeyinde yapılan değerlendirmelerde herhangi bir floresan sinyal elde edilemedi. Ayrıca, fruktoz varlığı ve yokluğu arasında rfp transkripsiyon seviyelerinde belirgin bir fark gözlemlenmedi. Bu bulgular, fruktoz ile indüklenebilen ekspresyon sisteminde promotör aktivitesinin beklenen seviyede indüksiyon ile çalışmadığını ve transkripsiyon sürecinin translasyona dönüşmediğini göstermiştir. Çalışma, fruktoz ile indüklenebilen ekspresyon sistemlerinin etkinliği üzerine yapılan araştırmalara katkı sağlamakta ve genetik düzenleyici elemanların optimizasyonuna yönelik yeni çalışmalar için temel oluşturmaktadır. Gelecekte yapılacak çalışmalar, rfp geninin kodon optimizasyonu ile ekspresyon seviyesinin artırılması, farklı promotör sistemlerinin kullanılması ve farklı floresan proteinlerinin kullanım potansiyelinin araştırılması yönünde ilerleyebilir.

Cereibacter sphaeroides is a photosynthetic, facultative anaerobic, and Gram-negative bacterium. Due to its metabolic versatility and the ability to be genetically manipulated, it is considered a potential host for biotechnological applications. Fluorescent proteins absorb light at specific wavelengths and emit light at longer wavelengths. Thanks to these properties, they have a wide range of applications in biotechnology and molecular biology. RFP (Red Fluorescent Protein) is widely used as a significant tool in biomedical imaging and intracellular analyses due to its long-wavelength emission. In this thesis study, an expression vector inducible by fructose was developed to test the usability of C. sphaeroides as a cell factory for recombinant protein production. The RFP gene was used to evaluate the functionality of the vector. Within this scope, the rfp gene was cloned into the fructose-inducible pFRU2 expression vector, and molecular biology methods were used to confirm the cloning process. The rfp gene was excised with appropriate restriction enzymes and integrated into the pFRU2 vector using both traditional cloning and Gibson Assembly methods. The recombinant vector was transferred to the C. sphaeroides O.U.001 strain via conjugation, and colony PCR, restriction enzyme digestion analysis, and sequencing were used to identify successful clones. The results showed that rfp was successfully cloned into the pFRU2 vector and that recombinant strains were confirmed. RT-qPCR analyses were performed to determine the transcription levels of the target gene, and the presence of rfp transcripts was detected. However, no fluorescent signal was observed in protein-level evaluations. Additionally, no significant difference was observed in rfp transcription levels in the presence or absence of fructose. These findings indicate that the promoter activity in the fructose-inducible expression system did not function at the expected induction level, and the transcription process did not translate into protein production. This study contributes to research on the efficiency of fructose-inducible expression systems and lays the foundation for future work aimed at optimizing genetic regulatory elements. Future studies may focus on increasing expression levels through codon optimization of the rfp gene, using different promoter systems, and exploring the potential of other fluorescent proteins.