Onkoprotein c-MYC'in hücresel lokalizasyonunu belirleyen moleküllerin geliştirilmesi

Birçok kanser türünün gelişiminde önemli bir etkisi olan c-MYC onkoproteini transkripsiyon faktörü olarak hücrede birçok genin anlatımının düzenlenmesinde rol oynamaktadır. Bu genler hücre büyümesi, proliferasyonu ve apoptozu, translasyon, transkripsiyon, hücre döngüsü gibi önemli birçok hücresel fonksiyonları yönetir. C-Myc geninin amplifikasyonu, kromozom translokasyonu, retroviral promotör katılması gibi aşırı aktifleşmesine neden olan etkenler hücresel büyüme ve çoğalma kontrolünün kaybolmasına ve dolayısıyla kanser oluşumuna olanak tanımaktadır. C-Myc’in aktive olabilmesi için Max yapısı ile heterodimerizasyon gereklidir. Zayıf prognoz ve düşük sağkalım ile ilişikilendirilen c-MYC mutasyonlarına bağlı kanserleri hedeflemek için literatürde doğrudan veya dolaylı olarak c-MYC yolağını inhibe eden yaklaşımlar çalışılmıştır. MYC seviyesini ve/veya hücresel lokalizasyonunu tespit eden, küçük moleküler probların kullanıldığı yaklaşımlar sınırlıdır ve bu alanda daha fazla araştırılma yapılmasına ihtiyaç vardır. Proje kapsamında c-MYC proteinine bağlanan bir modül ile BODIPY floresan probunun birleştirildiği, c-MYC’in hücrede görüntülenmesine imkan veren bir prob üretilmiştir. Probun yüksek kuantum verimine sahip olduğu tespit edilmiş, konfokal mikroskobu ve akış sitometri analizleri ile c-MYC proteininin görüntülenebildiği ispatlanmıştır. C-MYC’i hedefleyen siRNA kullanıldığında floresan sinyalinin üç kattan fazla azaldığı tespit edilmiş olup probun bu proteine spesifik bağlandığı gösterilmiştir. Çekirdek boyası DAPI ile beraber yapılan analizler probun DAPI ile Pearson korelasyon katsayısının 0.989 olduğunu göstermektedir. Bu durum, probun çekirdekte lokalize olan c-MYC proteini görüntülendiğine işaret etmektedir. Probun uygulama dozunda insan akciğer hücrelerine toksik etki oluşturduğu görülmüştür. Probun yapısında c-MYC bağlanan modülünün inhibitör özelliğinden yola çıkılarak elde edilen bileşiğin teranostik özellikleri de incelenmiştir. Prob uygulaması sonucu izole edilen RNA, RT-PCR yöntemi ile kantifiye edilmiş ve probun c-MYC altyolağında yer alan siklin D gen anlatımını doza bağlı olarak istatistiksel olarak anlamlı şekilde %50’den fazla azalttığı görülmüştür. Hücre göçünü kontrol grubuna göre 12 kattan fazla azaltılabildiği tespit edilmiştir ve bu bulgular bileşiğin anti-metastatik etki gösterme potansiyelini göstermektedir. Elde edilen veriler kolay elde edilebilir, kuantum verimi yüksek BODIPY temelli probun teranostik etki göstererek hem c-MYC’i görüntülemek için hem de kanser proliferasyonu için önemli siklin D geninin anlatımını baskılamak için kullanılabileceğine işaret etmektedir.

The c-MYC oncoprotein, which is critical in the development cancer, plays significant roles in regulating the expression of many genes in the cell as a transcription factor. These genes regulate many important cellular functions such as cell growth, proliferation and apoptosis, translation, transcription, and cell cycle. Factors that cause c-Myc over-activation, such as gene amplification, chromosome translocation, and retroviral promoter insertion, leads to the loss of cellular growth and proliferation control and cause cancer formation. Heterodimerization with the Max is required for c-Myc activation. Approaches that directly or indirectly inhibit the c-MYC pathway have been studied in the literature to target cancers associated with c-MYC mutations and characterized with poor prognosis and low survival. Small probe approaches to detect MYC levels and/or cellular localization are limited and requires more research. Within the scope of the project, a probe was produced that combines a c-MYC protein binding module and the BODIPY fluorescent probe, allowing the visualization of c-MYC in the cell. It was determined that the probe has a high quantum yield, and the c-MYC protein is shown to be visualized with confocal microscopy and flow cytometry analyses with the use of the probe. When siRNA targeting c-MYC was used, the fluorescence signal decreased more than threefold, which indicates that the probe specifically binds to this target protein. Analyses performed with the nuclear dye DAPI showed that the Pearson correlation coefficient of the probe with DAPI was 0.989. This indicated that the probe visualized the c MYC protein localized in the nucleus. It was observed that the probe has toxic effect on human lung cells at the applied dose. The theranostic properties of the compound were also examined since the c-MYC binding module is a c-MYC inhibitor. The RNA isolated from the cells after the probe application was quantified by RT-PCR method and it was observed that the probe decreased the cyclin D gene expression located in the downstream of c-MYC pathway by more than 50% in a statistically significant manner, depending on the dose. It was found that cell migration could be reduced by more than 12-fold compared to the control group, and these findings demonstrate the potential of the compound to exhibit anti-metastatic effects. The obtained data indicate that the BODIPY-based probe, which is easily obtainable and has high quantum yield, can be used to both visualize c-MYC protein and suppress cyclin D expression, which is important for cancer proliferation. Hence, the probe can be considered as a theranostic agent.