Development of stimuli-responsive polymeric vehicles for siRNA delivery

Controlled drug delivery technology is a rapidly evolving field driven by contributions of scientists from different disciplines, offering significant advantages over traditional methods, such as enhanced efficacy, reduced toxicity, and improved patient compliance and convenience. These delivery systems commonly utilize synthetic polymers as drug carriers, enabling treatments that were previously inaccessible. With this delivery system, siRNA can be delivered to specific cells. With its ability to specifically silence target genes, RNA interference shows great potential for treating a variety of diseases. There are many challenges to RNA interference. One major problem is to efficient and selective deliver genetic material such as small interfering RNA (siRNA) to targeted tissues and cells. In this project, a stimuli-responsive polymeric carrier systems for efficient target-selective siRNA delivery is developed. Polymer is made up of cationic pyridinium moieties to bind to negatively charged siRNA. Poly(4-vinyl pyridine) (P4VP) is a weak polybase with a pKa of 5.6 and is hydrophilic in the protonated state below pH 5.6 and hydrophobic in the unprotonated state above pH 5.6. P4VP is widely used in gene delivery, site-specific drug delivery, biosensors, antibacterial agents, and sensitive colloid and surface systems. In this project, this polymer was derivatized with 4-nitrobenzyl bromide to form pyridinium cations with the intension to capture siRNA. After derivatization, the zeta potential was found to increase from -6.98 mV to +22.8 mV and the derivatization was characterized by 1H NMR and FTIR methods. Nitro benzyl peaks appear on the NMR spectrum indicating 10% functionalization. It was evaluated that the new peak observed at 1346.27 cm⁻¹ in the FTIR spectrum originated from the nitro unit added to the structure. Nitroreductase (NTR) treatment resulted in nitrobenzyl removal as verified by NMR and also positive charge is reduced as detected through zeta potential. The negatively charged siRNA was bound to the polymer via electrostatic interactions. Positive charge of the polymer is aimed to be reduced upon reduction of nitrobenzyl units in hypoxic environment in the presence of NTR enzymes. Spontaneous detachment of the aniline from the structure will result in the release of siRNA targeting oncogene cMYC under these conditions. In hypoxic human lung cells, a significant decrease in the expression of genes involved in cMYC and related pathways was detected. Cancer cells with hypoxic microenvironment have more endogenous reductive enzymes than normal cells. Therefore, polymer could be made activatable in cancer cells and silence the specific gene in cancer cells. The thesis study would inspire the development of new carriers sensitive to cancer-microenvironment and support the research on selective therapies.

Kontrollü ilaç taşıma teknolojisi, farklı disiplinden bilim insanlarının katkılarıyla hızla gelişen bir alandır ve geleneksel tedavi yöntemlerine göre daha etkin, daha az toksisite gösteren ve gelişmiş hasta uyumu ve rahatlığı gibi önemli avantajlar sunar. Bu taşıma sistemleri genellikle ilaç taşıyıcı olarak sentetik polimerleri kullanır. Bu taşıyıcılar, daha önce erişilemeyen tedavilere olanak sağlar. Bu yöntem ile siRNA belirli hücrelere iletilebilir. Hedef genleri spesifik olarak susturma yeteneği ile RNA uygulamaları, çeşitli hastalıkların tedavisi için büyük potansiyel gösterir. RNA interferansına yönelik birçok zorluk vardır. Bu problemlerin en önemlilerinden biri siRNA gibi terapötik nükleik asitlerin hedeflenen dokulara ve hücrelere verimli ve seçici bir şekilde iletmektir. Bu projede, nükleik asitlerin hedef üzerinde salımını sağlayacak uyarı-duyarlı polimerik taşıyılar üretilmiştir. Polimer negatif yüklü siRNA’ya bağlanabilmesi için katyonik yüke sahip piridinyum birimleri ile türevlendirilmiştir. Poli(4-vinil piridin) (P4VP), pKa’sı 5.6 olan zayıf bir polibazdır ve bu pH’ın altında protonlanmış durumda iken hidrofilik, pH 5.6’nın üzerinde ise protonlanmamış durumda hidrofobiktir. P4VP, gen dağıtımında, bölgeye özgü ilaç dağıtımında, biyosensörlerde, antibakteriyel ajanlarda ve hassas kolloid ve yüzey sistemlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu projede bu polimer, siRNA’yı yakalayabilen piridinyum katyonları oluşturmak üzere 4-nitrobenzil bromür ile türevlendirilmiştir. Türevlendirme sonrası zeta potansiyelinin -6.98 mV’dan +22.8 mV’a yükseldiği tespit edilmiş ve 1H NMR ve FTIR yöntemleri ile türevlendirme karakterize edilmiştir. NMR spektrumunda nitrobenzil biriminin piridin yapılarının %10’una bağlandığı görülmüştür. FTIR spektrumunda 1346.27 cm⁻¹’de gözlemlenen yeni pikin yapıya katılan nitro biriminden kaynaklandığı değerlendirilmiştir. nitroredüktaz (NTR) uygulaması sonrasında nitrobenzil piklerinin tamamen kaybolduğu NMR’da tespit edilmiş olup zeta potansiyelinin pozitif değerinde de azalma görülmüştür. Negatif yüklü siRNA polimere elektrostatik etkileşimler yoluyla bağlanmıştırdır. Nitrobenzil birimlerinin hipoksik ortamda NTR enzimlerinin varlığında indirgenerek kendiliğinden yapıdan kopması sonucu katyonik özelliğin azalması, onkogen cMYC’i hedefleyen siRNA’yı bu koşullarda bırakması amaçlanmıştır. Hipoksik insan akciğer hücre hattında yapılan deneylerde cMYC ve bağlantılı yolaklarda yer alan genlerin anlatımında anlamlı bir azalma tespit edilmiştir. Hipoksik mikroçevreye sahip kanserli hücrelerin, normal hücrelere göre daha fazla endojen indirgeyici enzimlere sahip olduğu bilinmektedir. Dolayısıyla bu polimerik sistemin kanserli hücrede daha aktif olması ve kanserli hücredeki spesifik geni susturması sağlanabilmiştir. Tez çalışmasının kanser-mikroçevresine duyarlı yeni taşıyıcıların geliştirilmesine ilham olacağı ve seçici terapi araştırmalarına destek olacağı düşünülmektedir.