LL-37 nanopartikülleri ile fonksiyonlandırılmış PCL/jelatin fiber örtünün in vitro 3 boyutlu yara modelinde etkinliğinin değerlendirilmesi

Rejeneratif tıp ve doku mühendisliği alanlarında skarsız yara iyileşmeyi sağlamada önemli gelişmeler olsa da halen mükemmel cilt iyileştirme konusu bir zorluk olarak karşımızdadır. Detaylı yara iyileşme süreçlerinin incelenmesinde, in vitro testler; spesifik bileşiklerin etkilerini ve buna bağlı genetik değişimleri değerlendirmede mükemmel bir araç olmaları nedeniyle önem kazanmaktadır. Yara iyileşme aşamalarındaki karmaşıklığı açıklamada iki boyutlu (2B) hücre kültürü yetersiz kalmakta bu süreçte in vitro üç boyutlu (3B) modellerin hücre matrisi ve hücre-hücre etkileşimleri tercih edilmektedir. Hücrelerin tercihi optimal hidrofiliklik, hücresel yapışma, göç ve çoğalma için çok sayıda hücre bağlanma yerine sahip olması açısından doğal polimerlerdir. Ancak doğal polimerlerin yeterli mekanik mukavemetinin olmaması, bir üretimden diğerine varyasyon göstermesi ve patojen bulaşma riskinden dolayı alternatifi sentetik polimerlerdir. Sentetik polimerler dayanıklı mekanik özellik yanında çeşitli çözücüler ve ısıl işlemlerle işlenebilir ancak hücre afinitesi, yüksek hidrofobiklik ve hücre tanıma bölgelerinin olmaması gibi özellikleri mevcuttur. Çözüm olarak doğal-sentetik kompozit polimerlerin kullanımı önerilmektedir. Doktora tez çalışmasında antimikrobiyal peptit (AMP) LL37 enkapsüle edilmiş kitosan nanoparçacıklarının (LL37-CSNP) elde edilmesi için kitosan nanopartiküller (CSNP) iyonotropik jelasyon yöntemi ile üretilmiş, ardından LL37, CSNP’ler ile enkapsüle edilmiştir. İkinci aşamada polikaprolakton (PCL) ve Jelatin (Jel) içeren kompozit polimer çözeltisinin elektro-eğirilmesi ile üretilen fiber mat üzerine LL37 CSNP’ler emdirilmiştir. Üçüncü aşamada fonksiyonlandırılmış fiber matın laboratuvar koşullarında üretilen 3B in vitro insan cilt moldellerine uygulanarak yara iyileştirici etkisi ve antibakteriyel etkisi değerlendirilmiştir. NP’ler ve fiberlerin morfolojileri FE-SEM ile analiz edilmiştir. Kompozit liflerin kimyasal yapılarını karakterize etmek için FTIR spektroskopisi yapılmıştır. Lifli ağın mekanik özellikleri ve ıslanabilirliği ölçülmüştür. Matların in vitro bozunma hızı, mat ağırlığındaki değişikliğin izlenmesiyle belirlenmiştir. Fiber matın antibakteriyel etkisi mikro plakadaki bakteri üremesi belirlenerek değerlendirilmiştir. In vitro üç boyutlu deri modelleri geliştirilmiştir. Dokular üzerinde hematoksilin eosin (H&E) boyama ve immünohistokimyasal incelemeler yapılmıştır. Sonuçlar değerlendirildiğinde, 15 µg/mL LL37 enkapsüle edilmiş olan CSNP’lerin boyutları 210,90±2.59 nm, polidispersite indeksi (PDI) 0,306±0.02 ve Zeta potansiyeli 51,21±0.93 bulunmuştur. 15-LL37-CSNP’lerde LL37 enkapsülesyon verimi %80 bulunurken, NP’lerden LL37 salımı birinci derece modeliyle uyumlu bulunmuştur. LL-37’nin küresel yapı sergileyenen 15-LL37-CSNP’ler göstermiş oldukları fizikokimyasal özellikleri, biyouyumlulukları ve antibakteriyel etkileri ile çalışmanın bir sonraki aşamasında fiberlerin fonksiyonlandırılması için uygun bulunmuştur. PCL/Jel fiber matın fizikokimyasal test sonuçları ortalama iv fiber çaplarının 510,3±227,61 nm olduğunu gösterirken, fiber matın hidrofilik özellikte olması ve biyouyumlu bulunması biyomedikal uygulamalar için uygunluğunu desteklemiştir. Doktora çalışmasının bir diğer aşaması olan in vitro üç boyutlu deri modellerinde H&E ve immünohistokimya analizleriyle involukrin, sitokeratin, laminin proteinlerinin ifadeleri mikroskopik olarak gösterilmiştir. 15-LL37 CSNP’lerin in vitro modellerde punch ile oluşturulan yaraların kapanmasına etkisi MTT analizi ve mikroskopik incelemelerle gösterilmiştir. Tez çalışmasında yara iyileştirme potansiyeli gösteren fonksiyonel biyomalzeme geliştirilmiş olup, yara iyileştirici etkinliği projede geliştirilen yara modellerinde doğrulanmıştır.

Despite significant advancements in regenerative medicine and tissue engineering aimed at achieving scarless wound healing, attaining perfect skin regeneration remains a major challenge. In the detailed investigation of wound healing processes, in vitro tests have gained prominence as they are excellent tools for evaluating the effects of specific compounds and associated genetic changes. However, two-dimensional (2D) cell cultures are insufficient to fully explain the complexity of wound healing stages; thus, in vitro three-dimensional (3D) models are preferred due to their ability to mimic cell-matrix and cell cell interactions. Natural polymers are typically favored for cell compatibility, offering optimal hydrophilicity, cellular adhesion, migration, and proliferation due to the abundance of cell-binding sites. Nevertheless, natural polymers often suffer from poor mechanical strength, batch-to-batch variability, and a potential risk of pathogen contamination. To overcome these limitations, synthetic polymers serve as alternatives, offering robust mechanical properties and processability with various solvents and thermal methods. However, their drawbacks include low cell affinity, high hydrophobicity, and lack of recognition sites for cells. As a solution, the use of natural–synthetic composite polymers has been proposed. In this doctoral study, antimicrobial peptide (AMP) LL37-loaded chitosan nanoparticles (LL37-CSNPs) were developed. Initially, chitosan nanoparticles (CSNPs) were produced using the ionotropic gelation method, followed by the encapsulation of LL37 into these CSNPs. In the second phase, LL37-CSNPs were embedded onto a fibrous mat fabricated by electrospinning a composite polymer solution containing polycaprolactone (PCL) and gelatin (Gel). In the third phase, the functionalized fibrous mat was applied to lab-grown 3D in vitro human skin models to evaluate its wound healing capacity and antibacterial activity. The morphology of the nanoparticles and fibers was analyzed by FE-SEM. FTIR spectroscopy was performed to characterize the chemical structure of the composite fibers. The mechanical properties and wettability of the fibrous mats were also measured. The in vitro degradation rate of the mats was determined by monitoring weight changes over time. The antibacterial effect of the mats was evaluated based on bacterial growth inhibition in microplates. Additionally, 3D in vitro skin models were developed. vi Histological (H&E staining) and immunohistochemical analyses were conducted to assess the expression of key skin proteins such as involucrin, cytokeratin, and laminin. Based on the results, LL37-CSNPs containing 15 µg/mL of LL37 exhibited a particle size of 210.90 ± 2.59 nm, a polydispersity index (PDI) of 0.306 ± 0.02, and a zeta potential of 51.21 ± 0.93 mV. The encapsulation efficiency of LL37 in 15-LL37 CSNPs was found to be 80%, and LL37 release from the nanoparticles followed a first-order kinetic model. Due to their physicochemical properties, biocompatibility, and antibacterial effects, the spherical 15-LL37 CSNPs were deemed suitable for fiber functionalization in the next phase of the study. The physicochemical tests of the PCL/Gel fiber mats indicated an average fiber diameter of 510.3 ± 227.61 nm, hydrophilic character, and biocompatibility, supporting their potential for biomedical applications. In the final phase of the doctoral research, the expression of involucrin, cytokeratin, and laminin proteins in the 3D in vitro skin models was demonstrated via H&E staining and immunohistochemistry. The wound-healing effect of 15 LL37-CSNPs on punch-induced wounds in the models was confirmed by MTT assay and microscopic evaluations. As a result, a functional biomaterial with demonstrated wound healing potential was developed, and its effectiveness was validated using the custom-designed wound models in this study.